酶联免疫吸附试验（ELISA）

一、原理

1. 酶标记抗球蛋白测定抗体法间接法：将抗原结合于载体〔琼脂糖小珠、塑料（聚乙烯或聚苯乙烯）管和塑料血凝平板〕表面，用含有抗体的血清，孵育已经致敏的载体，然后洗去过多的血清成分，加入酶标记抗球蛋白，使与载体表面的抗原－抗体复合体相结合，洗去多余的酶标记抗球蛋白，最后加底物，测定被酶降解后的底物量，相当于抗体存在量。

2. 双抗体测定抗原法（夹心法）：以含有特异性抗体的免疫球蛋白，致敏载体表面，然后将含有抗原的试液与已经致敏的载体孵育，洗去过多的抗原试液，加入含有酶标记特异性抗体的结合物，结合物即与载体表面的抗原－抗体复合物相结合，最后加底物，测定被酶降解的底物量，相当于抗原的存在量。

3. 酶标记抗原竞争法测定抗原：将含有特异性抗体的免疫球蛋白，吸附于载体表面，以含有酶标记抗原和“未知”抗原相混，孵育载体表面，测定底物水解的百分比，即为酶标记抗原量。

二、操作方法及结果判断及标准

1. 微量平板法：

A. 间接法：试验前，将具有96凹孔的塑料微量血凝平板用稀释抗原致敏，即在每一凹孔中滴加200μl已用0.05mol/ L pH7.4的PBS－吐温洗涤3次，最后一次洗涤后，将凹孔内水液甩尽，这种微量平板即可用于试验。试验时，于每一凹孔中加入200μl已用PBS－吐温稀释的血清，振摇平板后，置室温中2h，如上法洗涤，再加已用PBS－吐温稀释的酶标记物，振摇后，置于室温2h，再如上法洗涤，然后加200μl底物（如为HRP标记物常用底物为邻苯二胺溶液。配法是将10mg邻苯二胺溶于25ml pH5.0柠檬酸缓冲液，再加适量30％过氧化氢。如为碱性磷酸酶标记物，所用底物为对硝基苯酚磷酸盐，是将对硝基苯酚磷酸盐溶于10％二乙醇胺缓冲液。缓冲液配置为：二乙醇胺97ml，先加蒸馏水800ml，用1mol/L HCL校正pH值至9.8时，再加蒸馏水至1000ml），至室温30min，最后在每一凹孔中加入50μl 2mol/L H2SO4（或NaOH），使酶反应停止。如微量平板的凹孔中呈现黄色时，即为阳性反应。试验结果需用ELISA检测仪测定，读取492nm波段的消光值。

B. 双抗体法：在微量血凝平板的每一凹孔中，加入200μl含有4~10μg/ml特异性抗血清的pH9.6涂层缓冲液（NaCO3 1.6g，NaHCO3 2.9g，蒸馏水1000ml），置于37℃中，孵育5h，如上法洗涤，加200μl已用PBS－吐温稀释的抗原，置于40℃过夜，洗涤后，加200μl酶标记抗体球蛋白，于37℃孵育2h，洗涤，然后用上法加底物和测定反映结果。

（不要）2. 塑料管法：取11×35mm的塑料管，加入1ml抗原（溶于含0.02％叠氮钠的0.1mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液），置于37℃中，孵育3h，然后将涂有抗原的塑料管，冷藏保存备用。试验前先将管子用含有0.05％吐温－20 的0.9％氯化钠溶液洗涤3次，每次可静置几分钟，然后用吸引法将水液吸尽，加入1ml已用0.05％吐温－20和0.025%叠氮钠的PBS稀释血清，置于室温，转动4h，将管子用上法再洗涤。然后加入1ml碱性磷酸酶标记物，置于室温过夜。再洗管子，并加1ml底物（对硝基苯酚磷酸盐）。底物浓度为1mg/ml（溶于含有0.001mol/L氯化镁的0.05mol/L pH9.6的磷酸盐缓冲液），置于室温中1～2h，最后加2mol/L NaOH终止反应。底物与酶相遇，即被水解，释放呈现黄色的对硝基苯酚。当塑料管呈现黄色时，即为阳性反应。试验结果可用分光光度计在400nm波段测定管子的吸收值来判断。

3. 其它改进或改变方法：A.塑料管经抗原致敏后，再加2ml含有4%牛血清白蛋白的碳酸钠缓冲液，置于4℃过夜，然后保存备用；B. 除底物外，其他加试液后，均于37℃中，经30min进行试验；C. 酶标记物以含有1％牛血清白蛋白的PBS作成所需的稀释度；D. 加底物后，置于室温中1～2h。

三、注意事项

1. 检测前，须选择吸附性能好，非特异性吸附少的微量反应板；每批反应板在应用前须根据上诉要求进行预测。

2. 检测前，应以标准阳性血清和阴性血清对比测定，以确定阳性和阴性反应结果的阈值。

3. 检测大批标本时，每块反应板都应设置标准阳性血清和阴性血清对照。

4. 加底物前，反应板经洗涤、甩干后，应速加底物，不能在空气中放置过久，以免酶活力下降影响反应结果，特别在高温季节，加底物前已甩干的反应板，不宜在空气中暴露过久。

5. 反应板经使用后，不宜再用，否则会影响反应结果。

6. 目前各种型号的酶标检测仪性能很不一致，检测时需根据各自的仪器，确定阳性和阴性反应的阈值。

7. 检测时，可选用4～10％牛血清白蛋白或10％小牛血清和0.05～0.5％去垢剂（吐温－20）去减少非特异性吸附。

8. 在检测标本和酶结合物稀释剂内加入4％聚乙二醇（PEG，分子量6000～7000），可增高阳性检出率。

四、应用范围    可用于多种寄生虫病免疫学诊断。