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间接红细胞凝集试验(IHA)

【 作者:管理员     发布时间:2016-08-16 18:24 】

一、原理    IHA是以红细胞为载体,吸附预先制备的特异性抗原或抗体(此即致敏作用,吸附有抗原或抗体的红细胞称致敏红细胞)作为试剂,检测标本中的相应抗体或抗原的一种血清学方法。其特点是抗原与其相应抗体之间的特异性反应,借红细胞凝集现象表现出来。这是一种定性的检测方法,根据凝集出现与否判定阳性或阴性结果,也可作半定量检测,即将标本作一系列对倍稀释后进行反应,以出现阳性反应的最高稀释度作为滴度。

二、操作方法   

1. 在微量血凝板上将被检样品编号写上。

2. 各排第一孔,用微量稀释器加稀释液(pH7.2PBS内含1%正常兔血清)0.09ml,以后各排孔加稀释液0.05ml。

3. 各排第一孔各加被检血清0.01ml,然后用稀释器进行倍比稀释,最后弃去0.05ml,每孔含稀释血清0.05ml。

4. 每孔各加2%致敏红细胞悬液0.01ml。

5. 将血凝板置振荡器上振荡2~3min,或用手充分摇匀,覆以盖板,静置2~4h后读取结果。

6. 若用稀释棒作倍比稀释:A. 各排第一孔用微量滴管加被检血清(1:10)0.05ml,以后各排孔加稀释液0.025ml;B. 用稀释棒做倍比稀释;C. 将血凝板放于振荡器上,在振荡同时用微量滴管滴加致敏红细胞,每孔0.025ml,其余同上。

7. 对照设置:检测抗体时每次应设兔血清盐水对照,已知阳性和阴性血清对照。检测抗原时兔血清盐水对照,已知抗原对照,正常球蛋白致敏红细胞对照。

三、结果判断及标准 

“++++”红细胞形成明显凝集块,布满全孔底,甚至出现卷边。

“+++”红细胞出现薄层凝块,面积较上者小。

“++”红细胞部分沉积孔底,边缘松散,面积较小。

“+”红细胞沉于孔底,周围有轻微凝集小点。

“-”红细胞沉于孔底,呈园扣状,周边光滑整齐。

待检标本≥“++”为阳性。

四、注意事项   

1. 红细胞浓度:致敏红细胞浓度与试验的敏感性和特异性有密切关系,在一定范围内,致敏红细胞浓度和血凝效价成反比,若浓度过的,则假阳性增高,过高则不敏感,一般认为1%~2%为宜。可根据自己的实验选择适当浓度。

2. 血凝板类型:血凝试验目前多采用微量方法,国内产生血凝板主要有U型和V型两种。血凝模型在很大程度上取决于血凝板的类型。阴性沉降模型V型板比U型板更为清晰典型;而敏感性则U型板比V型板高2~3个稀释度。

3. 用稀释棒须注意以下几点: A. 稀释棒久用后很难吸入待测血清,需用生理盐水预湿15min。 B. 稀释棒头空隙的标准容量为25μl,棒头前端只要接触血清,深入液面不超过1/2棒头,很快(1~2秒)血清即可充满棒头空隙而达到取样要求。若棒头插入血清过深,棒头部和颈部外侧粘有一定量的血清,影响结果的准确性。C. 棒头转动次数不得少于50次。

4. 血清标本:未完全凝固收缩而分离出的血清样本,吸血清时若吸入纤维蛋白块,明显阻止红细胞下沉,造成假阳性。

5. 血凝板使用后用10%过氧乙酸浸泡,常在孔底有变性蛋白沉积而出现假阳性,用15%安替福民(NaOCl)处理无假阳性。血凝板用旧后,特别是稀释棒反复旋转,使血凝板孔底出现环纹而出现假阳性。

五、应用范围    用于多种寄生虫病的免疫学诊断,如血吸虫病,肺吸虫病,脑囊虫病,华支睾吸虫病等。

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