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酶联免疫吸附试验(ELISA)

【 作者:管理员     发布时间:2016-08-16 18:24 】

一、原理

1. 酶标记抗球蛋白测定抗体法间接法:将抗原结合于载体〔琼脂糖小珠、塑料(聚乙烯或聚苯乙烯)管和塑料血凝平板〕表面,用含有抗体的血清,孵育已经致敏的载体,然后洗去过多的血清成分,加入酶标记抗球蛋白,使与载体表面的抗原-抗体复合体相结合,洗去多余的酶标记抗球蛋白,最后加底物,测定被酶降解后的底物量,相当于抗体存在量。

2. 双抗体测定抗原法(夹心法):以含有特异性抗体的免疫球蛋白,致敏载体表面,然后将含有抗原的试液与已经致敏的载体孵育,洗去过多的抗原试液,加入含有酶标记特异性抗体的结合物,结合物即与载体表面的抗原-抗体复合物相结合,最后加底物,测定被酶降解的底物量,相当于抗原的存在量。

3. 酶标记抗原竞争法测定抗原:将含有特异性抗体的免疫球蛋白,吸附于载体表面,以含有酶标记抗原和“未知”抗原相混,孵育载体表面,测定底物水解的百分比,即为酶标记抗原量。

二、操作方法及结果判断及标准

1. 微量平板法:

A. 间接法:试验前,将具有96凹孔的塑料微量血凝平板用稀释抗原致敏,即在每一凹孔中滴加200μl已用0.05mol/ L pH7.4的PBS-吐温洗涤3次,最后一次洗涤后,将凹孔内水液甩尽,这种微量平板即可用于试验。试验时,于每一凹孔中加入200μl已用PBS-吐温稀释的血清,振摇平板后,置室温中2h,如上法洗涤,再加已用PBS-吐温稀释的酶标记物,振摇后,置于室温2h,再如上法洗涤,然后加200μl底物(如为HRP标记物常用底物为邻苯二胺溶液。配法是将10mg邻苯二胺溶于25ml pH5.0柠檬酸缓冲液,再加适量30%过氧化氢。如为碱性磷酸酶标记物,所用底物为对硝基苯酚磷酸盐,是将对硝基苯酚磷酸盐溶于10%二乙醇胺缓冲液。缓冲液配置为:二乙醇胺97ml,先加蒸馏水800ml,用1mol/L HCL校正pH值至9.8时,再加蒸馏水至1000ml),至室温30min,最后在每一凹孔中加入50μl 2mol/L H2SO4(或NaOH),使酶反应停止。如微量平板的凹孔中呈现黄色时,即为阳性反应。试验结果需用ELISA检测仪测定,读取492nm波段的消光值。

B. 双抗体法:在微量血凝平板的每一凹孔中,加入200μl含有4~10μg/ml特异性抗血清的pH9.6涂层缓冲液(NaCO3 1.6g,NaHCO3 2.9g,蒸馏水1000ml),置于37℃中,孵育5h,如上法洗涤,加200μl已用PBS-吐温稀释的抗原,置于40℃过夜,洗涤后,加200μl酶标记抗体球蛋白,于37℃孵育2h,洗涤,然后用上法加底物和测定反映结果。

(不要)2. 塑料管法:取11×35mm的塑料管,加入1ml抗原(溶于含0.02%叠氮钠的0.1mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液),置于37℃中,孵育3h,然后将涂有抗原的塑料管,冷藏保存备用。试验前先将管子用含有0.05%吐温-20 的0.9%氯化钠溶液洗涤3次,每次可静置几分钟,然后用吸引法将水液吸尽,加入1ml已用0.05%吐温-20和0.025%叠氮钠的PBS稀释血清,置于室温,转动4h,将管子用上法再洗涤。然后加入1ml碱性磷酸酶标记物,置于室温过夜。再洗管子,并加1ml底物(对硝基苯酚磷酸盐)。底物浓度为1mg/ml(溶于含有0.001mol/L氯化镁的0.05mol/L pH9.6的磷酸盐缓冲液),置于室温中1~2h,最后加2mol/L NaOH终止反应。底物与酶相遇,即被水解,释放呈现黄色的对硝基苯酚。当塑料管呈现黄色时,即为阳性反应。试验结果可用分光光度计在400nm波段测定管子的吸收值来判断。

3. 其它改进或改变方法:A.塑料管经抗原致敏后,再加2ml含有4%牛血清白蛋白的碳酸钠缓冲液,置于4℃过夜,然后保存备用;B. 除底物外,其他加试液后,均于37℃中,经30min进行试验;C. 酶标记物以含有1%牛血清白蛋白的PBS作成所需的稀释度;D. 加底物后,置于室温中1~2h。

三、注意事项

1. 检测前,须选择吸附性能好,非特异性吸附少的微量反应板;每批反应板在应用前须根据上诉要求进行预测。

2. 检测前,应以标准阳性血清和阴性血清对比测定,以确定阳性和阴性反应结果的阈值。

3. 检测大批标本时,每块反应板都应设置标准阳性血清和阴性血清对照。

4. 加底物前,反应板经洗涤、甩干后,应速加底物,不能在空气中放置过久,以免酶活力下降影响反应结果,特别在高温季节,加底物前已甩干的反应板,不宜在空气中暴露过久。

5. 反应板经使用后,不宜再用,否则会影响反应结果。

6. 目前各种型号的酶标检测仪性能很不一致,检测时需根据各自的仪器,确定阳性和阴性反应的阈值。

7. 检测时,可选用4~10%牛血清白蛋白或10%小牛血清和0.05~0.5%去垢剂(吐温-20)去减少非特异性吸附。

8. 在检测标本和酶结合物稀释剂内加入4%聚乙二醇(PEG,分子量6000~7000),可增高阳性检出率。

四、应用范围    可用于多种寄生虫病免疫学诊断。

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